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霉菌和酵母檢測怎么鑒定?標準方法與快檢有哪些不同?

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下面是我們在檢測霉菌酵母時遇到的幾個問題:



1、計數前的鑒定



計數霉菌酵母結果前是需要鑒定菌落是否是真菌的。



霉菌的形態相對比較明顯,不容易被混淆。但是對于酵母來說,培養基里抑制細菌的成分,例如氯霉素在此的劑量不足以抑制所有的細菌種類。部分細菌會在孟加拉紅培養基上生長的也很好,如下圖:

被紅色圓圈圈起來的菌落是不是很像酵母?然而這只是一種革蘭氏陽性的球菌而已,是細菌。



簡單來說,真菌比細菌大得多。鏡檢如果使用低倍鏡(10-40倍)就可以清晰觀察到菌的輪廓,那么就是真菌。相反,如果需要油鏡等高倍鏡(1000倍以上),那就是細菌。



2、不同形態的菌落做鏡檢

 “不同”形態的菌落,這個“不同”也是有區別的。如下圖所示:

2中紅色和藍色圓圈內的這兩種“不同”形態的菌落,差別太大,確實是不相同的種類。

3中的四個“不同”的形態的菌落,其實是同一種酵母,這是釀酒酵母菌的標準菌株在孟加拉紅培養基上因為生長位置不同而體現出的差異。生長在瓊脂表面的菌落,白色透粉紅、圓形;生長在瓊脂內部的菌落,出現菱形或花瓣形;生長在瓊脂底部和平皿接觸面上的菌落,呈現出較深粉紅色的圓形。

使用傾注法,同一種酵母可能會出現不同的形態。因此,挑取有代表性的菌落做鏡檢,我們要慎之又慎。不然會做重復工作或漏檢。

3、是否必須培養5

GB 4789.15-2016 中把“培養 5 d,觀察并記錄”修改為“觀察并記錄培養至第 5 d 的結果。”

部分霉菌適宜生長的溫度稍高,如煙曲霉等,如果依然使用28℃培養,酶的催化活性降低,代謝速度減慢,繁殖就會慢,就不能提前計數。還有幾類霉菌:毛霉、犁頭霉、木霉等生長快、菌絲多,最好在48小時以內計數,否則菌絲就會覆蓋整個平皿,無法準確計數。

另外,有的菌株如果培養時間不足,形態特征會不明顯,不容易區分鑒別,因此需要延長培養時間。

 

4、標準方法與快檢方法相比

依據GB 4789.15-2016 ,食品實驗室檢測霉菌酵母的時間在很多情況下顯得過長,這也是近年來快速檢測方法需求大增的原因。很多實驗室在進行快檢產品驗收時,通過對比實驗,發現使用黑曲霉菌和釀酒酵母菌,在孟加拉紅瓊脂上生長速度也很快,大約2-3天就可以報告結果,和一些快檢方法相當。

GB 4789.282013 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》附錄E中要求,實驗室常備驗收孟加拉紅瓊脂或馬鈴薯葡萄糖培養基所使用的霉菌酵母的標準菌株為黑曲霉菌和釀酒酵母菌,因此大部分實驗室如果做國標法和快檢方法的對比實驗,往往使用的也是這兩種菌株。

但是我們要知道,GB 4789.282013 中附錄E,半定量質控評定標準G值所采用的質控菌株(目標菌),生長繁殖速度相對較快,特征明顯。以釀酒酵母菌為例,如果對純菌液樣液(無抑制成分、無干擾菌)傾注孟加拉紅瓊脂,28℃下培養48-72h就足以計數,繼續培養也不過是使菌落變的更大。如果培養溫度升高1-2℃,這一速度還將更快。同理,黑曲霉菌3天也已經足夠。

現有的類似培養基培養的快檢方法,如3M霉菌酵母快速檢測紙片,或者Biokar霉酵快速顯色培養基等檢測霉酵的時間大都為2-3天,這樣一來,對比實驗結果往往在培養2-3天后就可以全部觀察到,會給人造成一種錯覺:經過國際權威組織認證的快速檢測方法,檢測時間和孟加拉紅瓊脂差不多,那么日常檢測中,培養了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長菌,是不是就可以下結論了呢?

實際上,培養了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長菌,在第四天或第五天開始出現霉菌酵母的情況是存在的。

以《SN/T 3266食品微生物檢驗方法確認技術規范》為例,對非標方法(定量)選擇性的要求就包括:包容性≥98% 30個目標菌株),并不能以某種菌株的結果代表所有情況。

在本文前面已經提到,霉菌酵母的種類非常之多,GB 4789.15中將培養時間定在5天,也是考慮到在此培養條件下生長繁殖比較緩慢的情況。除少情形(培養時間過長會導致蔓延等)外,培養時間一定要足夠。 

Symphony 瓊脂可對所有人類和動物食品中的酵母菌和霉菌進行計數,與其水活性無關。也可用于生產區域環境樣品的控制。該方法允許在54小時后進行計數,而不是使用標準方法的5天。

 

 

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